Rtn-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404072-ACT

RTN3 codifica la reticulon-3 (Rtn-3), una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che contribuisce a modellare l’architettura tubulare del RE e alla curvatura di membrana e alle dinamiche di traffico. Rtn-3 partecipa all’omeostasi del RE, alla crescita dei neuriti e alla regolazione dei processi di trasporto intracellulare che influenzano la proteostasi. Nei sistemi neuronali, RTN3 è stata collegata a vie che controllano l’elaborazione della proteina precursore dell’amiloide (APP) e l’integrità assonale, mettendo in relazione le risposte allo stress del RE e il mantenimento sinaptico con i meccanismi delle malattie neurodegenerative. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di RTN3 vengono quindi studiate nel contesto del rimodellamento del RE, del controllo qualità delle proteine e delle reti di segnalazione rilevanti per la patologia del SNC.

Rtn-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RTN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rtn-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RTN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RTN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rtn-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RTN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rtn-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rtn-3 nelle cellule tumorali con espressione di RTN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.