RNF168 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402174-ACT

RNF168 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina che amplifica la segnalazione del danno al DNA a livello della cromatina ubiquitinando substrati di tipo istonico H2A nei siti di rottura a doppio filamento. Questa cascata dipendente dall’ubiquitina favorisce il reclutamento e la ritenzione di fattori chiave della riparazione, supportando vie coordinate della risposta al danno al DNA, tra cui la segnalazione ATM, il controllo dei checkpoint e la scelta della via di riparazione. L’attività di RNF168 è strettamente legata alla stabilità del genoma: un’alterazione della sua funzione può perturbare la segnalazione del danno basata sulla cromatina e compromettere una riparazione fedele. La disregolazione della segnalazione ubiquitinica associata a RNF168 è stata studiata nel contesto di difetti ereditari della riparazione del DNA e della biologia tumorale, rendendola rilevante per indagini meccanicistiche sul mantenimento del genoma.

RNF168 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF168 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF168 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF168 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF168, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF168. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF168 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF168 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF168 nelle cellule tumorali con espressione di RNF168 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.