Ras-GRF2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404141-ACT

Il gene umano RASGRF2 codifica Ras-GRF2, un fattore di scambio di nucleotidi guaninici regolato da calcio e diacilglicerolo che attiva RAS e può modulare la segnalazione di RAC, collegando segnali extracellulari alle dinamiche intracellulari della cascata MAPK/ERK. Ras-GRF2 integra input provenienti da recettori tirosin-chinasici e da vie associate ai GPCR, influenzando proliferazione, differenziamento, rimodellamento del citoscheletro e segnali legati alla plasticità neuronale. Nel sistema nervoso contribuisce alla segnalazione dipendente dall’attività e alla funzione sinaptica, mentre in altri contesti cellulari può rimodellare i programmi trascrizionali indotti dai fattori di crescita tramite effettori dipendenti da ERK. La deregolazione della segnalazione della via RAS è ampiamente rilevante per fenotipi oncogenici e neurosviluppativi, rendendo RASGRF2 un nodo utile per analizzare l’attivazione di RAS e il controllo del feedback in modo dipendente dal contesto.

Ras-GRF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RASGRF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ras-GRF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RASGRF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RASGRF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ras-GRF2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RASGRF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ras-GRF2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ras-GRF2 nelle cellule tumorali con espressione di RASGRF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.