Raptor Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400960-ACT

Il gene umano RPTOR codifica Raptor, un componente di impalcatura essenziale del complesso mTOR 1 (mTORC1) che recluta substrati come S6K e 4E-BP1 per coordinare gli input di nutrienti, energia e fattori di crescita con la sintesi proteica, la soppressione dell’autofagia e la riprogrammazione metabolica. Attraverso la regolazione della specificità di substrato e della localizzazione di mTORC1, Raptor influenza la crescita cellulare, la progressione del ciclo cellulare, la biogenesi dei ribosomi e la segnalazione associata ai lisosomi. Un’attività deregolata di RPTOR/mTORC1 è stata associata ad alterazioni della segnalazione anabolica osservate in oncologia, nelle malattie metaboliche e in contesti di neuro-sviluppo e neurodegenerazione, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per la dissezione delle vie di segnalazione. La modulazione dell’espressione di RPTOR fornisce un approccio diretto per studiare i feedback tra la segnalazione PI3K–AKT, AMPK e le vie di sensing dei nutrienti che plasmano l’omeostasi cellulare.

Raptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPTOR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Raptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPTOR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPTOR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Raptor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPTOR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Raptor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Raptor nelle cellule tumorali con espressione di RPTOR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.