Pygopus 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402894-ACT

PYGO2 codifica Pygopus 2, un coattivatore nucleare che funge da effettore associato alla cromatina della segnalazione canonica Wnt/β-catenina. Interagendo con i complessi trascrizionali β-catenina/TCF e favorendo il reclutamento di ulteriore macchinario trascrizionale, PYGO2 contribuisce alla regolazione della proliferazione, della specificazione di linea e di programmi trascrizionali di tipo staminale. L’attività di Pygopus 2 è collegata al controllo epigenetico dei loci bersaglio di Wnt e si intreccia con processi quali la progressione del ciclo cellulare e la differenziazione epiteliale. Un’espressione deregolata di PYGO2 e l’alterazione dell’output della via Wnt sono state associate a stati trascrizionali oncogeni e alla biologia tumorale in molteplici contesti, a supporto della sua rilevanza come nodo meccanicistico per studi mirati sulla via.

Pygopus 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PYGO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pygopus 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PYGO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PYGO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pygopus 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PYGO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pygopus 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pygopus 2 nelle cellule tumorali con espressione di PYGO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.