PRPK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-405589-ACT-2

O TP53RK humano codifica a PRPK (proteína quinase relacionada à p53), um componente catalítico do complexo KEOPS que sustenta a modificação essencial N6-treonilcarbamoiladenosina (t6A) em tRNAs, influenciando assim a fidelidade da tradução e a proteostase global. A PRPK tem sido associada à regulação do crescimento celular e de programas adaptativos ao estresse, com conexões relatadas a contextos de sinalização associados à p53 e a um controle mais amplo de processos ligados à proliferação. A desregulação genética de TP53RK/PRPK está associada a fenótipos de desenvolvimento e neurodesenvolvimento, incluindo a síndrome de Galloway–Mowat, ressaltando a importância do metabolismo de RNA mediado pelo KEOPS para a homeostase do organismo. A edição gênica de TP53RK possibilita estudos mecanísticos da tradução dependente de modificações de tRNA, da montagem do complexo KEOPS e dos efeitos a jusante sobre o ciclo celular, a manutenção do genoma e vias de resposta ao estresse em modelos celulares humanos.

PRPK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TP53RK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PRPK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TP53RK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TP53RK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PRPK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TP53RK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PRPK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PRPK em células tumorais com expressão de TP53RK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.