PRP19 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404130-ACT

PRPF19 codifica la proteina umana PRP19, un componente centrale del complesso PRP19/CDC5L che accoppia lo splicing del pre-mRNA al mantenimento del genoma. PRP19 funge da impalcatura (scaffold) e da ligasi E3 dell’ubiquitina nell’attivazione dello spliceosoma ed è stata implicata nel coordinamento tra trascrizione, processamento dell’RNA e segnalazione della risposta al danno al DNA, al fine di preservare la fedeltà della replicazione. Attraverso questi ruoli, l’attività di PRPF19 influenza la progressione del ciclo cellulare e le vie della proteostasi che determinano la tolleranza allo stress cellulare. La disregolazione dei programmi di splicing e riparazione del DNA associati a PRPF19 è spesso studiata nel contesto della trasformazione oncogena, della neurodegenerazione e di altri disturbi in cui il metabolismo dell’RNA e la stabilità del genoma risultano alterati.

PRP19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRPF19 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRP19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRPF19 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRPF19, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRP19. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRPF19 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRP19 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRP19 nelle cellule tumorali con espressione di PRPF19 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.