Prohibitin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401282-ACT

PHB2 codifica per proibitina 2, una proteina scaffold conservata, arricchita nella membrana interna mitocondriale e nel nucleo, che contribuisce a mantenere l’architettura delle creste mitocondriali, l’integrità della catena respiratoria e il controllo della mitofagia. Proibitina 2 partecipa alle vie di controllo qualità dei mitocondri, inclusi il rimodellamento di membrana dipendente da OPA1 e il turnover associato a PINK1/Parkin, e può influenzare il ciclo cellulare e i programmi trascrizionali attraverso interazioni con recettori nucleari e fattori associati alla cromatina. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di PHB2 sono state collegate a una fosforilazione ossidativa compromessa, a un aumento della segnalazione mediata da specie reattive dell’ossigeno e a cambiamenti nella suscettibilità all’apoptosi. Queste funzioni rendono PHB2 rilevante per studi meccanicistici sulla riprogrammazione metabolica, sulle risposte allo stress e sulla disfunzione mitocondriale associata a neurodegenerazione e cancro.

Prohibitin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PHB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Prohibitin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PHB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PHB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Prohibitin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PHB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Prohibitin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Prohibitin 2 nelle cellule tumorali con espressione di PHB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.