Pr-Set7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415759-ACT

KMT5A codifica a Pr-Set7 (SETD8), uma metiltransferase de lisina que contém o domínio SET e que catalisa a monometilação da histona H4 na Lys20 (H4K20me1), uma marca de cromatina associada à maturação de nucleossomos acoplada à replicação e à integridade do genoma. A atividade de Pr-Set7 coordena a progressão do ciclo celular, o licenciamento da replicação do DNA e as respostas a danos no DNA por meio da regulação da compactação da cromatina e do recrutamento de fatores de reparo. A expressão ou atividade desregulada de KMT5A/Pr-Set7 tem sido associada a estados epigenéticos alterados, estresse replicativo e fenótipos proliferativos relatados em múltiplos contextos de câncer. Como uma enzima de cromatina na interseção entre o controle epigenético e a sinalização de checkpoints, KMT5A é amplamente estudada na regulação transcricional, no crosstalk entre vias de reparo de DNA e na dinâmica da cromatina.

Pr-Set7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KMT5A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Pr-Set7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KMT5A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KMT5A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Pr-Set7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KMT5A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Pr-Set7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Pr-Set7 em células tumorais com expressão de KMT5A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.