POH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405591-ACT

PSMD14 codifica per POH1, una subunità metalloproteasica JAMM/MPN+ della particella regolatoria 19S del proteasoma umano 26S, che rimuove catene di ubiquitina legate tramite K48 durante l’elaborazione dei substrati. Accoppiando la deubiquitinazione alla degradazione proteasomiale, POH1 contribuisce a mantenere l’omeostasi proteica e a modulare il turnover di regolatori chiave coinvolti nelle risposte al danno al DNA, nella progressione del ciclo cellulare e nella segnalazione adattativa allo stress. L’attività di PSMD14 si interfaccia con il controllo ubiquitina-dipendente dei processi associati alla cromatina e può influenzare vie come la segnalazione di NF-κB attraverso la degradazione regolata dei componenti della via. La deregolazione della deubiquitinazione associata al proteasoma è stata collegata ad anomalie della proteostasi e a fenotipi di instabilità del genoma rilevanti per la biologia del cancro e la ricerca sulla neurodegenerazione.

POH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSMD14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

POH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSMD14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSMD14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di POH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSMD14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da POH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via POH1 nelle cellule tumorali con espressione di PSMD14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.