PICK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403683-ACT

La PICK1 (protein interacting with C kinase 1) umana è una proteina scaffold contenente domini PDZ e BAR che collega il rilevamento della curvatura di membrana al traffico recettoriale e alla trasduzione del segnale. PICK1 regola l’endocitosi, il riciclo e la localizzazione sinaptica di diverse proteine di membrana, inclusi i recettori del glutammato di tipo AMPA e vari trasportatori, influenzando la plasticità sinaptica e la segnalazione intracellulare mediata da chinasi. Attraverso i suoi ruoli nel traffico vescicolare e nell’organizzazione del citoscheletro, PICK1 partecipa alla comunicazione neuronale e ai processi di trasporto polarizzato in molteplici tipi cellulari. Vie associate a PICK1 deregolate sono state investigate nel contesto di disfunzioni neurologiche e di un’alterata omeostasi dei recettori, rendendola un nodo utile per lo studio delle reti di segnalazione prossimali alla membrana.

PICK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PICK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PICK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PICK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PICK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PICK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PICK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PICK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PICK1 nelle cellule tumorali con espressione di PICK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.