PHOSPHO1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433594-ACT

Phospho1 codifica PHOSPHO1, una fosfatasi arricchita nei tessuti in via di mineralizzazione che idrolizza la fosfoetanolammina e la fosfocolina per generare fosfato inorganico, supportando l’avvio della deposizione di idrossiapatite mediata dalle vescicole della matrice. Nel topo, l’attività di PHOSPHO1 si integra con l’omeostasi del fosfato e con i programmi di sviluppo scheletrico, agendo insieme a regolatori della mineralizzazione come la fosfatasi alcalina per modulare la funzione di osteoblasti e condrociti. L’alterazione o la disregolazione di PHOSPHO1 è associata a fenotipi di mineralizzazione ossea compromessa e a una maturazione modificata della matrice extracellulare, rendendola rilevante per studi sulla fragilità scheletrica e sui disturbi dello sviluppo osseo. Come nodo della biologia della mineralizzazione, viene spesso analizzata nei percorsi che governano l’osteogenesi, la transizione da cartilagine a osso e la gestione locale del fosfato.

PHOSPHO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Phospho1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PHOSPHO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Phospho1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Phospho1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PHOSPHO1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Phospho1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PHOSPHO1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PHOSPHO1 nelle cellule tumorali con espressione di Phospho1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.