PGE synthase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402085-ACT

PTGES codifica la prostaglandina E sintasi-1 microsomiale (mPGES-1), un enzima terminale inducibile della cascata dell’acido arachidonico che converte la PGH2 derivata da COX in prostaglandina E2 (PGE2). Questa attività collega gli stimoli infiammatori alla produzione di mediatori lipidici bioattivi e contribuisce alla modulazione della segnalazione citochinica, del tono vascolare, della sensibilizzazione al dolore e della funzione delle cellule immunitarie. PTGES è regolato a valle delle vie di NF-κB e MAPK e agisce in sinergia con gli enzimi PTGS1/2 e PLA2 per determinare l’output degli eicosanoidi. Alterazioni della segnalazione PTGES/PGE2 sono state associate a stati infiammatori cronici e a programmi del microambiente associato ai tumori, rendendolo un bersaglio comune per studi meccanicistici della biologia legata all’infiammazione.

PGE synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTGES senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGE synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTGES nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTGES, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGE synthase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTGES nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGE synthase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGE synthase nelle cellule tumorali con espressione di PTGES silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.