PDE4D CRISPR Activationプラスミド (m): sc-433646-ACT

マウスのPde4dは、cAMP特異的ホスホジエステラーゼであるホスホジエステラーゼ4D（PDE4D）をコードしており、cAMPを5′-AMPへ加水分解するとともに、PKAおよびEPAC依存性シグナル伝達の振幅や空間的な局在（コンパートメント化）を規定します。細胞内セカンドメッセンジャーの基調（トーン）を調節することで、PDE4DはGPCR駆動性応答、CREBシグナル伝達などの転写プログラム、ならびに細胞増殖・分化・免疫調節といった過程に影響します。PDE4D活性はA-キナーゼアンカリングタンパク質（AKAP）によるコンパートメント化シグナル伝達と統合されており、cAMPエフェクターとのクロストークを介してMAPK/ERK経路のダイナミクスにも影響し得ます。PDE4Dを介したcAMP代謝回転の異常は炎症や神経生物学的表現型に関与することが示唆されており、マウスモデルにおける疾患関連シグナル伝達研究の機序的ハブとしての有用性を支持します。

PDE4D CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Pde4dの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PDE4D CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Pde4d 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPde4d転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PDE4Dの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPde4d遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPDE4D依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPde4d発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPDE4D経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。