PARP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400046-ACT

PARP1 kodiert die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1, einen nukleären Sensor für DNA-Schäden, der die PARylierung von sich selbst und anderen chromatinassoziierten Proteinen katalysiert, um die DNA-Reparatur zu koordinieren. PARP1 spielt eine zentrale Rolle in der Basenexzisionsreparatur und der Reparatur von Einzelstrangbrüchen und beeinflusst zudem über Wechselwirkungen mit Histonen und Reparatur-Scaffold-Proteinen das Chromatin-Remodeling, die Stabilität von Replikationsgabeln und die Transkriptionsregulation. Durch Crosstalk mit der ATM/ATR-Signalübertragung und umfassenderen Netzwerken zur Genomstabilisierung trägt PARP1 dazu bei, die genomische Integrität unter oxidativem und Replikationsstress zu erhalten. Eine fehlregulierte PARP1-Aktivität und eine veränderte DNA-Reparaturkapazität sind häufig mit Phänotypen genomischer Instabilität assoziiert, die in verschiedenen Krebs-Kontexten beobachtet werden, sowie mit stressbezogenen Reaktionen, die für Neurodegeneration relevant sind, was PARP1 als mechanistisches Ziel in der DNA-Reparaturforschung unterstützt.

PARP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PARP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PARP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PARP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PARP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PARP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PARP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PARP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PARP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PARP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.