PAR4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401142-ACT

PAWR codifica la proteina pro-apoptotica PAR4 (prostate apoptosis response-4), un regolatore del destino cellulare contenente un dominio leucine zipper che modula reti trascrizionali e di risposta allo stress. PAR4 partecipa all’apoptosi intrinseca e al controllo della crescita influenzando la segnalazione di NF-κB, le vie di sopravvivenza PKC/AKT e i programmi di morte cellulare caspasi-dipendenti, con ruoli aggiuntivi nello stress del reticolo endoplasmatico (ER) e nella proteostasi. Un’alterata attività di PAWR/PAR4 è stata associata a una disregolazione dell’apoptosi, all’omeostasi epiteliale e neuronale e, in modo dipendente dal contesto, a collegamenti con la biologia tumorale e i processi neurodegenerativi. Queste funzioni rendono PAWR un nodo utile per studiare il crosstalk tra segnalazione di sopravvivenza, regolazione trascrizionale e morte cellulare programmata.

PAR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAWR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAWR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAWR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAR4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAWR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAR4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAR4 nelle cellule tumorali con espressione di PAWR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.