P2X6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416264-ACT

Il gene umano **P2RX6** codifica la subunità **P2X6** dei canali ionici P2X attivati dall’ATP, che mediano un rapido ingresso di cationi in risposta a nucleotidi extracellulari. P2X6 può contribuire ad assemblaggi eteromerici dei canali, che modulano la segnalazione dipendente da Ca2+, l’eccitabilità di membrana e programmi trascrizionali a valle collegati alla neurotrasmissione purinergica e alla modulazione immunitaria. Attraverso reti di segnalazione purinergica, l’attività associata a P2X6 può influenzare processi quali l’omeostasi del calcio, il rilascio vescicolare e l’integrazione di segnali infiammatori. Un’alterata percezione dell’ATP extracellulare e la segnalazione purinergica ionotropica sono state implicate nella fisiopatologia neuroinfiammatoria e cardiovascolare, motivando studi meccanicistici della regolazione di P2RX6 in tipi cellulari rilevanti.

P2X6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2RX6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2X6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2RX6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2RX6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2X6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2RX6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2X6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2X6 nelle cellule tumorali con espressione di P2RX6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.