P/Q-type Ca⁺⁺ CP α1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404267-ACT

CACNA1A codifica a subunidade α1A formadora do poro dos canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo P/Q (CaV2.1), que medeiam o influxo de Ca²⁺ ativado por alta voltagem em células excitáveis. Em neurónios, o CaV2.1 está enriquecido nas zonas ativas pré-sinápticas, onde acopla a despolarização da membrana à fusão de vesículas sinápticas dependente de Ca²⁺, moldando a probabilidade de libertação de neurotransmissores, a plasticidade de curto prazo e a excitabilidade das redes. A atividade do canal integra-se com vias de sinalização reguladas por Ca²⁺, incluindo a modulação dependente de calmodulina, a fosforilação por PKA/PKC e programas transcricionais a jusante responsivos à dinâmica intracelular de Ca²⁺. Variação genética ou desregulação de CACNA1A está associada a fenótipos neurológicos envolvendo circuitos cerebelares e corticais, sustentando a sua utilização em estudos de fisiologia sináptica e mecanismos do neurodesenvolvimento.

P/Q-type Ca++ CP α1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CACNA1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

P/Q-type Ca++ CP α1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CACNA1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CACNA1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de P/Q-type Ca++ CP α1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CACNA1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de P/Q-type Ca++ CP α1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via P/Q-type Ca++ CP α1A em células tumorais com expressão de CACNA1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.