Plásmido CRISPR de Activación (m) NUDT8: sc-425987-ACT

El gen Nudt8 de ratón codifica NUDT8, un miembro de la familia de hidrolasas Nudix que cataliza la hidrólisis de derivados de difosfatos de nucleósidos para mantener la calidad del pool de nucleótidos y limitar la acumulación de metabolitos potencialmente tóxicos. Al controlar los niveles de especies de nucleótidos oxidadas o aberrantes, NUDT8 contribuye a la homeostasis metabólica y ayuda a proteger los ácidos nucleicos frente a la incorporación errónea y el daño. Las enzimas Nudix se asocian comúnmente con respuestas al estrés celular, el equilibrio redox y la integridad del ADN/ARN, por lo que la expresión y regulación de Nudt8 son relevantes para estudios sobre estabilidad genómica y señalización asociada a la inflamación. Las vías de “saneamiento” de nucleótidos alteradas se investigan con frecuencia en el contexto de la biología del cáncer, la neurodegeneración y la desregulación metabólica, donde los cambios en el recambio de nucleótidos pueden influir en la carga mutacional y en los programas de supervivencia celular.

NUDT8 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Nudt8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NUDT8 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Nudt8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Nudt8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NUDT8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Nudt8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NUDT8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NUDT8 en células tumorales con expresión de Nudt8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.