NRF-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-400938-ACT-2

Il gene umano NRF1 codifica il nuclear respiratory factor 1 (NRF-1), un fattore di trascrizione specifico per la sequenza che coordina l’espressione dei geni mitocondriali codificati dal nucleo, inclusi componenti della catena di trasporto degli elettroni, la macchina di trascrizione/replicazione mitocondriale (ad es. TFAM) e fattori che supportano la fosforilazione ossidativa e la biogenesi mitocondriale. NRF-1 integra segnali cellulari legati all’energia e allo stato redox con i programmi di crescita cellulare regolando reti trascrizionali connesse alla proteostasi, alla biosintesi dell’eme e alla comunicazione mitocondrio–nucleo, influenzando così il rimodellamento metabolico e l’adattamento allo stress. Un’attività deregolata di NRF1/NRF-1 è stata associata a disfunzione mitocondriale e ad alterazioni della bioenergetica osservate in contesti di neurodegenerazione, disturbi cardiometabolici e cancro. L’editing genetico o la perturbazione di NRF1 consente studi meccanicistici sulla regolazione dei geni mitocondriali, sulla capacità respiratoria e sui circuiti trascrizionali in modelli cellulari umani, inclusa la mappatura delle vie e analisi genotipo–fenotipo mediante letture omiche.

NRF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NRF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NRF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NRF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NRF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NRF-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NRF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NRF-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NRF-1 nelle cellule tumorali con espressione di NRF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.