NPRL2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402875-ACT

NPRL2 umano codifica un componente centrale del complesso GATOR1, un importante regolatore negativo della segnalazione di mTORC1 che collega la disponibilità di amminoacidi al controllo della crescita cellulare. Favorendo la limitazione dell’attività di mTORC1, NPRL2 sostiene le risposte allo stress da carenza di nutrienti, la regolazione dell’autofagia e l’omeostasi metabolica, influenzando la sintesi proteica e la progressione del ciclo cellulare. Alterazioni dell’espressione o della funzione di NPRL2 sono state associate a una deregolazione della via di mTOR osservata in diversi contesti di proliferazione aberrante e adattamento allo stress, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sul controllo della crescita. NPRL2 viene inoltre utilizzato come nodo per interrogare i circuiti di sensing dei nutrienti e i programmi trascrizionali a valle che determinano la sopravvivenza cellulare e la capacità biosintetica.

NPRL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NPRL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPRL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NPRL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NPRL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPRL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NPRL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPRL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPRL2 nelle cellule tumorali con espressione di NPRL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.