Npl4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403787-ACT

O gene humano **NPLOC4** codifica a Npl4, um cofator central da ATPase p97/VCP que atua em conjunto com a UFD1 para reconhecer e extrair substratos ubiquitinados para processamento pelo proteassoma. Por meio de seus domínios de ligação à ubiquitina, a Npl4 ajuda a coordenar a degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD), a remoção de cadeias nascente associadas a ribossomos que ficaram estagnadas e um controle mais amplo da proteostase que influencia a progressão do ciclo celular e a sinalização adaptativa ao estresse. Essas vias se cruzam com respostas a danos no DNA e programas transcricionais inflamatórios ao regular a degradação de proteínas-chave de sinalização e associadas à cromatina. A desregulação do eixo VCP–UFD1–NPL4 está ligada a estresse proteotóxico, homeostase proteica alterada e maior vulnerabilidade em estados proliferativos, tornando o **NPLOC4** um alvo relevante para estudos mecanísticos em neurodegeneração e biologia do câncer.

Npl4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPLOC4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Npl4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPLOC4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPLOC4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Npl4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPLOC4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Npl4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Npl4 em células tumorais com expressão de NPLOC4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.