NHERF-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404885-ACT

SLC9A3R1 codifica a NHERF-1 (fator regulador do trocador Na+/H+ 1), uma proteína de andaime com domínio PDZ que organiza receptores de membrana, transportadores de íons e enzimas de sinalização na membrana plasmática apical. A NHERF-1 modula o transporte epitelial de íons e fluidos por meio de interações com NHE3 (SLC9A3), CFTR e GPCRs, e conecta esses complexos ao citoesqueleto de actina via proteínas ERM. Ao coordenar o tráfego de receptores e a propagação de sinais, a NHERF-1 influencia vias que incluem a sinalização cAMP/PKA, PI3K–AKT e respostas dependentes do contexto de Wnt/β-catenina. A desregulação da expressão ou da localização da NHERF-1 tem sido associada a alterações da homeostase epitelial e a fenótipos de sinalização relevantes para a biologia do câncer, a regulação do transporte renal e intestinal e microambientes inflamatórios.

NHERF-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC9A3R1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NHERF-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC9A3R1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC9A3R1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NHERF-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC9A3R1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NHERF-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NHERF-1 em células tumorais com expressão de SLC9A3R1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.