Nek9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404971-ACT

NEK9 codifica la chinasi serina/treonina Nek9, un regolatore chiave della funzione del centrosoma e della progressione mitotica. Nek9 coordina l’assemblaggio del fuso e la dinamica dei microtubuli attivando chinasi NIMA-correlate a valle e integrando eventi di fosforilazione che regolano la separazione dei centrosomi, l’ingresso in mitosi e la citocinesi. Grazie al suo ruolo nel controllo del ciclo cellulare e nella stabilità del genoma, un’alterata attività di NEK9 è rilevante negli studi sull’instabilità cromosomica e sui fenotipi associati alla proliferazione osservati nella biologia del cancro e nei disturbi dello sviluppo. NEK9 interseca anche vie di segnalazione sensibili allo stress che possono influenzare la fedeltà dei checkpoint e l’uscita dalla mitosi.

Nek9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEK9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nek9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEK9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEK9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nek9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEK9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nek9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nek9 nelle cellule tumorali con espressione di NEK9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.