NDRG1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402294-ACT

NDRG1 (N-myc downstream regulated gene 1) codifica una proteina citoplasmatica responsiva allo stress, implicata nella differenziazione cellulare, nell’omeostasi dei lipidi e del ferro e nella modulazione delle reti di trasduzione del segnale. NDRG1 è regolato dall’ipossia, da p53 e dalla segnalazione oncogenica di MYC, ed è stata collegata a vie che controllano la proliferazione, le dinamiche epitelio-mesenchimali e le risposte allo stress cellulare. Nella biologia umana, un’alterata espressione di NDRG1 è stata associata alla progressione tumorale e al comportamento metastatico in molteplici contesti tissutali, oltre che a fenotipi di neuropatia periferica ereditaria. Queste caratteristiche rendono NDRG1 un nodo utile per analizzare programmi trascrizionali che collegano lo stress del microambiente a cambiamenti dello stato cellulare.

NDRG1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDRG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NDRG1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDRG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDRG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NDRG1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDRG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NDRG1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NDRG1 nelle cellule tumorali con espressione di NDRG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.