NDR1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402716-ACT

STK38 codifica NDR1, una chinasi serina/treonina della famiglia NDR/LATS che funge da effettore centrale nella segnalazione correlata alla via Hippo, coordinando proliferazione cellulare, apoptosi e omeostasi tissutale. NDR1 integra segnali a monte provenienti dalle chinasi MST e da proteine scaffold per regolare la duplicazione del centrosoma, la progressione mitotica e l’organizzazione del citoscheletro, collegando la segnalazione chinasi al controllo del ciclo cellulare e ai programmi di polarità. Contribuisce inoltre alle risposte allo stress e all’immunità innata attraverso la modulazione di reti trascrizionali e di chinasi, con effetti a valle sulla sopravvivenza cellulare e sulla segnalazione infiammatoria. Un’attività di NDR1 disregolata o alterazioni nella connettività della via sono state associate, in sistemi sperimentali, a un controllo aberrante della crescita e a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per i meccanismi delle malattie neurodegenerative.

NDR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STK38 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NDR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STK38 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STK38, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NDR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STK38 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NDR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NDR1 nelle cellule tumorali con espressione di STK38 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.