Ndfip1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403470-ACT

NDFIP1 (Ndfip1) codifica una proteina adattatrice endosomiale che interagisce con le ubiquitina ligasi E3 HECT della famiglia NEDD4 e contribuisce ad accoppiare le proteine di membrana all’ubiquitinazione, al traffico intracellulare e al turnover. Attraverso la regolazione dello smistamento dipendente dall’ubiquitina, Ndfip1 contribuisce al controllo dell’intensità della segnalazione recettoriale, della dinamica endosomiale e delle vie di proteostasi che modellano stati cellulari immunitari e responsivi allo stress. Un’attività alterata di NDFIP1 è stata implicata in una segnalazione infiammatoria disregolata e nell’omeostasi immunitaria, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sull’adattamento della segnalazione e sul controllo delle vie mediate dall’ubiquitina. In modelli cellulari umani, la modulazione dell’espressione di NDFIP1 viene utilizzata per analizzare come il targeting delle ligasi E3 influenzi i programmi trascrizionali a valle e i fenotipi cellulari associati alla regolazione immunitaria.

Ndfip1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDFIP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ndfip1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDFIP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDFIP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ndfip1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDFIP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ndfip1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ndfip1 nelle cellule tumorali con espressione di NDFIP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.