NALCN CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403432-ACT

NALCNは、非選択性ナトリウム漏れチャネルタンパク質をコードしており、電位非依存性の背景Na⁺コンダクタンスを担う孔形成性膜成分として、神経細胞やその他の興奮性細胞における静止膜電位および固有の興奮性の設定に寄与します。基礎的な脱分極駆動を調整することで、NALCNの機能は、リズミカルな発火、シナプス統合、膜電位の恒常性制御を調節するシグナル伝達ネットワークと交差します。NALCNの活性または発現の破綻は、呼吸リズムの異常や筋緊張低下などを含む神経発達・神経運動系の表現型と関連づけられており、興奮性依存的な回路機能における役割を反映しています。ヒト細胞モデルでは、NALCNを調節することにより、膜の電気生理、イオンチャネル制御、ならびに興奮性の変化に伴う下流の転写応答を研究するための扱いやすい手段が得られます。

NALCN CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性NALCNの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

NALCN CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における NALCN 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はNALCN転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性NALCNの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のNALCN遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるNALCN依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびNALCN発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるNALCN経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。