mtTFA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401208-ACT

TFAM codifica il fattore di trascrizione mitocondriale A (mtTFA), una proteina legante il DNA del gruppo ad alta mobilità (HMG) che impacchetta il DNA mitocondriale (mtDNA) in nucleoidi e coordina la replicazione e la trascrizione dell’mtDNA. mtTFA è centrale per la biogenesi mitocondriale, per la capacità di fosforilazione ossidativa e per il mantenimento dell’integrità del genoma mitocondriale attraverso la regolazione del numero di copie di mtDNA e dell’accessibilità dei promotori. Alterazioni dell’espressione di TFAM sono associate a una respirazione modificata, a un aumento della segnalazione di stress mitocondriale e a un’ampia riprogrammazione metabolica, rendendolo rilevante per studi su neurodegenerazione, disfunzioni cardiometaboliche e rimodellamento mitocondriale associato al cancro. In quanto nodo chiave nella comunicazione mitocondrio-nucleo, TFAM è spesso utilizzato per indagare la segnalazione retrograda, l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno e la suscettibilità all’apoptosi.

mtTFA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mtTFA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mtTFA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mtTFA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mtTFA nelle cellule tumorali con espressione di TFAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.