MITF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400401-ACT

Il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF) è un fattore di trascrizione bHLH-LZ determinante per la linea cellulare, che regola programmi responsabili dello sviluppo dei melanociti, della pigmentazione, della sopravvivenza e della differenziazione. Nelle cellule umane, MITF integra input di segnalazione provenienti da vie quali MAPK/ERK e cAMP/PKA per coordinare la trascrizione di geni coinvolti nella biogenesi dei melanosomi, nelle risposte allo stress ossidativo, nella funzione lisosomiale e nel metabolismo cellulare. Un’attività di MITF deregolata è stata collegata ad alterazioni degli stati cellulari melanocitici, a disturbi della pigmentazione e alla biologia del melanoma, in cui cambiamenti nelle reti trascrizionali dipendenti da MITF possono influenzare proliferazione, invasione e adattamento allo stress. In quanto nodo trascrizionale centrale, MITF è ampiamente utilizzato come strumento molecolare per studiare l’identità cellulare, la plasticità trascrizionale e la regolazione genica dipendente dai segnali.

MITF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MITF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MITF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MITF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MITF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MITF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MITF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MITF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MITF nelle cellule tumorali con espressione di MITF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.