Plasmide CRISPR d'Activation (h) Mi2-b: sc-402185-ACT

CHD4 (Mi2-b) code une hélicase ATP-dépendante qui constitue une sous-unité catalytique centrale du complexe NuRD de remodelage de la chromatine et de désacétylation des histones. En couplant le repositionnement des nucléosomes à la répression transcriptionnelle, Mi2-b contribue à réguler des programmes d’expression génique spécifiques de lignée, le calendrier de réplication de l’ADN et l’accessibilité de la chromatine. CHD4 participe à des processus de maintien du génome, notamment la signalisation des dommages à l’ADN et le choix des voies de réparation, influençant la progression du cycle cellulaire et les réponses au stress réplicatif. Une activité CHD4/NuRD dérégulée ainsi que des altérations de CHD4 ont été associées à des états épigénétiques aberrants en cancérologie et à des phénotypes de troubles neurodéveloppementaux et de malformations congénitales, ce qui souligne sa pertinence pour des études mécanistiques de la régulation génique pilotée par la chromatine.

Mi2-b Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHD4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Mi2-b Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHD4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHD4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Mi2-b. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHD4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Mi2-b au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Mi2-b dans les cellules tumorales présentant une expression de CHD4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.