MDH2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402825-ACT

L’MDH2 umano codifica la malato deidrogenasi mitocondriale, che catalizza la conversione reversibile del malato in ossalacetato utilizzando NAD+/NADH, fornendo un passaggio enzimatico chiave nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA). Collegando l’equilibrio redox mitocondriale al metabolismo ossidativo, MDH2 sostiene la produzione di ATP, il flusso anaplerotico e l’accoppiamento metabolico tra glicolisi, ciclo TCA e biosintesi degli amminoacidi. L’attività di MDH2 influenza le risposte cellulari alla disponibilità di nutrienti e allo stress mitocondriale, con effetti a valle sulla gestione delle specie reattive dell’ossigeno e sull’adattamento bioenergetico. Un’espressione o una funzione alterata di MDH2 è stata associata alla riprogrammazione metabolica osservata in contesti proliferativi e neurodegenerativi, rendendola rilevante per studi sulla disfunzione mitocondriale e sulla segnalazione dipendente dal redox.

MDH2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MDH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MDH2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MDH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MDH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MDH2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MDH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MDH2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MDH2 nelle cellule tumorali con espressione di MDH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.