MARCH6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-437273-ACT

La MARCH6 umana codifica una ligasi E3 ubiquitina RING-CH associata alle membrane, localizzata principalmente nel reticolo endoplasmatico, dove coordina il turnover ubiquitina-dipendente di proteine di membrana mal ripiegate o regolate. Partecipa alla degradazione associata al RE (ERAD) e a programmi più ampi di proteostasi, accoppiando il riconoscimento del substrato all’ubiquitinazione e alla rimozione tramite proteasoma, influenzando così le vie dell’omeostasi dei lipidi e degli steroli. Attraverso la modulazione del controllo qualità proteico e della segnalazione metabolica, un’attività alterata di MARCH6 può rimodellare le risposte cellulari allo stress e i programmi trascrizionali a valle rilevanti per crescita disregolata e infiammazione. Queste funzioni rendono MARCH6 un bersaglio utile per studi meccanicistici che collegano la segnalazione dell’ubiquitina, lo stress del reticolo endoplasmatico e il rimodellamento metabolico in modelli cellulari rilevanti per la malattia.

MARCH6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MARCH6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MARCH6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MARCH6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MARCH6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MARCH6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MARCH6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MARCH6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MARCH6 nelle cellule tumorali con espressione di MARCH6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.