Plásmido CRISPR de Activación (h) MARCH6: sc-437273-ACT

La MARCH6 humana codifica una ligasa E3 de ubiquitina RING-CH asociada a membrana, localizada principalmente en el retículo endoplásmico, donde coordina la degradación dependiente de ubiquitina de proteínas de membrana mal plegadas o reguladas. Participa en la degradación asociada al RE (ERAD) y en programas más amplios de proteostasis al acoplar el reconocimiento del sustrato con la ubiquitinación y la eliminación por el proteasoma, influyendo así en las vías de homeostasis de lípidos y esteroles. Mediante la modulación del control de calidad proteico y de la señalización metabólica, una actividad alterada de MARCH6 puede remodelar las respuestas celulares al estrés y los programas transcripcionales aguas abajo relevantes para el crecimiento desregulado y la inflamación. Estas funciones hacen de MARCH6 un objetivo útil para estudios mecanísticos que vinculan la señalización por ubiquitina, el estrés del RE y la remodelación metabólica en modelos celulares relevantes para enfermedades.

MARCH6 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MARCH6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MARCH6 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MARCH6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MARCH6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MARCH6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MARCH6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MARCH6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MARCH6 en células tumorales con expresión de MARCH6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.