LRG-47 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421030-ACT

O gene Irgm1 de camundongo codifica a LRG-47, uma GTPase relacionada à imunidade induzível por interferon que se localiza em membranas intracelulares e sustenta a defesa celular autônoma contra patógenos intracelulares. A LRG-47 participa de programas antimicrobianos conduzidos por IFN-γ ao coordenar o tráfego vesicular, a maturação do fagossomo e processos relacionados à autofagia que influenciam o confinamento e a eliminação de patógenos. Ela interage com redes de sinalização da imunidade inata que moldam estados de ativação de macrófagos e respostas inflamatórias, conectando respostas a interferon à remodelação de organelas. A atividade desregulada de Irgm1 tem sido associada a suscetibilidade alterada a infecções e a imunopatologia, tornando-o relevante para estudos de interações hospedeiro–patógeno e de mecanismos de doenças inflamatórias.

LRG-47 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Irgm1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LRG-47 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Irgm1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Irgm1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LRG-47. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Irgm1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LRG-47 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LRG-47 em células tumorais com expressão de Irgm1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.