LMO4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401636-ACT

LMO4 (LIM domain only 4) codifica una proteina adattatrice nucleare costituita esclusivamente da domini LIM, che assembla complessi regolatori multiproteici della trascrizione senza legarsi direttamente al DNA. Facendo da ponte tra fattori di trascrizione e cofattori, LMO4 influenza le decisioni sul destino cellulare, i programmi di differenziamento e la proliferazione dipendente dal contesto tramite la modulazione delle reti di regolazione genica. È stata implicata in processi di sviluppo e nel patterning tissutale, e un’alterata espressione di LMO4 o delle sue circuiterie regolatorie è stata associata a un controllo trascrizionale disfunzionale in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi la biologia del cancro e fenotipi neuroevolutivi. In quanto co-regolatore nodale, LMO4 è spesso studiata per il suo ruolo nel modulare la trascrizione responsiva alle vie di segnalazione e gli output di espressione genica dipendenti dalla cromatina.

LMO4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LMO4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LMO4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LMO4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LMO4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LMO4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LMO4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LMO4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LMO4 nelle cellule tumorali con espressione di LMO4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.