LIN-41 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405036-ACT

TRIM71 (LIN-41) è una proteina legante l’RNA della famiglia TRIM-NHL che regola l’espressione genica post-trascrizionale attraverso il legame agli mRNA, la repressione della traduzione e le interazioni con il macchinario di silenziamento associato ai microRNA. Svolge ruoli chiave nello sviluppo embrionale e nel mantenimento delle cellule staminali modulando la progressione del ciclo cellulare, i programmi di differenziamento e l’impegno di linea. Nelle cellule umane, le reti regolatorie legate a TRIM71 si intersecano con vie che controllano proliferazione e morfogenesi, e la sua deregolazione è stata implicata in anomalie dello sviluppo e in fenotipi associati al cancro. La sua attività rappresenta un utile punto di accesso per studiare il metabolismo dell’RNA, i circuiti regolatori dello sviluppo e la segnalazione legata alla “stemness”.

LIN-41 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM71 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LIN-41 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM71 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM71, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LIN-41. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM71 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LIN-41 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LIN-41 nelle cellule tumorali con espressione di TRIM71 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.