LIMP II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402532-ACT

SCARB2 codifica la proteina integrale di membrana lisosomiale 2 (LIMP II), una glicoproteina di membrana di tipo III arricchita su endosomi tardivi e lisosomi, che sostiene la maturazione degli organelli, il traffico di membrana e l’omeostasi lisosomiale. LIMP II è necessaria per la corretta consegna e funzione delle idrolasi lisosomiali, incluso il suo ruolo ben caratterizzato come recettore per il trasporto della glucocerebrosidasi ai lisosomi. Attraverso queste attività, SCARB2 influenza la dinamica endolisosomiale, il flusso della via autofagia–lisosoma e le risposte cellulari allo stress proteostatico e del metabolismo lipidico. La disregolazione di SCARB2/LIMP II è pertanto rilevante per studi su fenotipi da accumulo lisosomiale, vie associate alla neurodegenerazione e interazioni ospite–patogeno che dipendono dall’ingresso endocitico e dalla funzione lisosomiale.

LIMP II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCARB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LIMP II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCARB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCARB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LIMP II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCARB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LIMP II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LIMP II nelle cellule tumorali con espressione di SCARB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.