IP3R-II Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421193-ACT

Il gene murino *Itpr2* codifica il recettore dell’inositolo 1,4,5-trifosfato di tipo 2 (IP3R-II), un canale di rilascio di Ca²⁺ del reticolo endoplasmatico che converte i segnali mediati da IP3 in transienti di calcio citosolico. IP3R-II agisce a valle delle vie dei GPCR e dei recettori tirosin-chinasici che stimolano la fosfolipasi C, modulando processi Ca²⁺-dipendenti quali secrezione, contrazione, metabolismo e risposte trascrizionali. Regolando la dinamica spaziotemporale del Ca²⁺ e l’omeostasi del Ca²⁺ nel RE, *Itpr2* influenza la segnalazione tra organelli e le risposte allo stress, spesso alterate in condizioni fisiopatologiche. La disregolazione della segnalazione del calcio mediata da IP3R è stata implicata in diversi meccanismi rilevanti per la malattia, inclusi cambiamenti dell’eccitabilità, difetti del trasporto epiteliale e alterazioni dell’omeostasi cellulare in contesti neurologici ed endocrini.

IP3R-II Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Itpr2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IP3R-II Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Itpr2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Itpr2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IP3R-II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Itpr2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IP3R-II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IP3R-II nelle cellule tumorali con espressione di Itpr2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.