IDH3A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404788-ACT

IDH3A codifica a subunidade alfa da isocitrato desidrogenase 3 mitocondrial, uma enzima dependente de NAD+ que catalisa a descarboxilação oxidativa do isocitrato em α-cetoglutarato no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Por meio da regulação da produção mitocondrial de NADH, a IDH3A sustenta a fosforilação oxidativa, o equilíbrio redox e o acoplamento metabólico entre a glicólise e vias biossintéticas. Alterações na atividade e na expressão de IDH3A têm sido associadas à reprogramação metabólica, disfunção mitocondrial e fenótipos proliferativos, tornando-a um ponto relevante para estudar o metabolismo energético e respostas ao estresse. As vias associadas à IDH3A intersectam-se com a sinalização de hipóxia, o manejo de espécies reativas de oxigênio e o fluxo de carbono para substratos anapleróticos e epigenéticos derivados do α-cetoglutarato.

IDH3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IDH3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IDH3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IDH3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IDH3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IDH3A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IDH3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IDH3A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IDH3A em células tumorais com expressão de IDH3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.