HB-EGF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400795-ACT

HBEGF codifica il fattore di crescita EGF-like legante l’eparina (HB‑EGF), un ligando ancorato alla membrana che può essere rilasciato per scissione proteolitica generando una forma solubile in grado di legarsi a EGFR ed ERBB4. La segnalazione di HB‑EGF attiva MAPK/ERK, PI3K–AKT e programmi trascrizionali correlati che regolano proliferazione, sopravvivenza, migrazione cellulare e interazioni epitelio–mesenchimali. È coinvolto nella riparazione delle ferite, nel rimodellamento vascolare e nella segnalazione infiammatoria attraverso un crosstalk dipendente dal contesto con le metalloproteasi ADAM e con componenti della matrice extracellulare. L’espressione deregolata di HBEGF e l’attivazione dell’asse EGFR sono frequentemente studiate in oncologia, nella fibrosi e nella fisiopatologia cardiovascolare come meccanismi che plasmano transizioni di stato cellulare e risposte del microambiente.

HB-EGF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HBEGF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HB-EGF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HBEGF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HBEGF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HB-EGF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HBEGF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HB-EGF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HB-EGF nelle cellule tumorali con espressione di HBEGF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.