GPRC5B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409271-ACT

GPRC5B (recettore accoppiato a proteina G di classe C, gruppo 5, membro B) è una proteina transmembrana di tipo GPCR-like orfana, implicata nella modulazione della segnalazione recettoriale a livello della membrana plasmatica e dei compartimenti endomembranosi. È stata associata alla regolazione di processi legati a MAPK/ERK e PI3K–AKT che influenzano proliferazione, differenziamento e risposte cellulari allo stress, con effetti dipendenti dal contesto sulla segnalazione infiammatoria e sull’omeostasi metabolica. Alterazioni dell’espressione di GPRC5B sono state riportate in molteplici tipi tumorali e in disturbi caratterizzati da una disregolazione delle vie immunitarie o metaboliche, a sostegno della sua utilità come nodo per lo studio dell’integrazione dei segnali. Di conseguenza, GPRC5B viene spesso analizzato in modelli di segnalazione oncogenica, nella biologia degli adipociti e delle cellule immunitarie e nel cross-talk recettoriale che influenza le transizioni di stato cellulare.

GPRC5B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPRC5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPRC5B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPRC5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPRC5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPRC5B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPRC5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPRC5B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPRC5B nelle cellule tumorali con espressione di GPRC5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.