Plásmido CRISPR de Activación (h) GNPDA2: sc-417433-ACT

El GNPDA2 humano (glucosamina-6-fosfato desaminasa 2) codifica una enzima citosólica que cataliza la conversión reversible de glucosamina-6-fosfato en fructosa-6-fosfato y amoníaco, conectando la vía biosintética de las hexosaminas con el flujo glucolítico central. Al modular la disponibilidad de UDP-GlcNAc para la glicosilación proteica ligada a N y a O, GNPDA2 puede influir en la detección de nutrientes, la proteostasis y los procesos de señalización que dependen de la regulación mediada por glicanos. Estudios genéticos y funcionales han asociado GNPDA2 con fenotipos metabólicos, incluidos el índice de masa corporal y el riesgo de obesidad, lo que resalta su relevancia en vías que gobiernan la homeostasis energética y el metabolismo sensible a la insulina. Estas características hacen de GNPDA2 un objetivo útil para investigar cómo la dinámica de la vía de las hexosaminas afecta el crecimiento celular, las respuestas al estrés y la reprogramación metabólica en sistemas modelo humanos.

GNPDA2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GNPDA2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GNPDA2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GNPDA2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GNPDA2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GNPDA2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GNPDA2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GNPDA2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GNPDA2 en células tumorales con expresión de GNPDA2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.