Glyoxalase I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401914-ACT

Il gene umano **GLO1** codifica la **gloossalasi I**, una metalloenzima zinco‑dipendente che catalizza il primo passaggio, limitante la velocità, del sistema della glicossalasi, convertendo il sottoprodotto glicolitico citotossico **metilgliossale** (come emitiacetale con il glutatione) in **S‑D‑lactoilglutatione**. Controllando i livelli di metilgliossale, GLO1 contribuisce a limitare la glicazione non enzimatica di proteine e acidi nucleici e riduce la formazione dei prodotti finali della glicazione avanzata (AGE), influenzando così l’omeostasi redox e le risposte cellulari allo stress. L’attività di GLO1 è associata al rimodellamento metabolico e alla capacità di detossificazione, processi spesso studiati in modelli di stress ossidativo, infiammazione e metabolismo del glucosio alterato. Una clearance deregolata del metilgliossale e un maggiore carico di glicazione sono pertinenti a fenotipi associati a malattia, tra cui resistenza all’insulina, disfunzione vascolare e tolleranza allo stress delle cellule tumorali, a supporto dell’impiego di GLO1 come nodo funzionale nella ricerca su metabolismo e proteostasi.

Glyoxalase I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Glyoxalase I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Glyoxalase I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Glyoxalase I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Glyoxalase I nelle cellule tumorali con espressione di GLO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.