GIT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402136-ACT

O GIT1 humano (G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1) é uma proteína de ancoragem (scaffold) associada a proteínas ativadoras de GTPase ARF que coordena a renovação das adesões focais, o tráfego de receptores e a remodelação do citoesqueleto de actina. Por meio de interações com proteínas como GRKs, paxilina e componentes de complexos de endocitose e de adesão, o GIT1 ajuda a integrar sinais de GPCRs e de receptores tirosina-quinase em vias que controlam a migração, a dinâmica de lamelipódios e a organização sináptica/neuronal. A sinalização ligada ao GIT1 tem sido estudada em contextos que incluem comportamento celular invasivo, respostas angiogênicas e vasculares e processos de neurodesenvolvimento nos quais a regulação de adesão e do citoesqueleto é fundamental. Assim, a expressão desregulada ou a conectividade alterada da rede do GIT1 é relevante para pesquisas mecanísticas sobre motilidade de células cancerosas, interações (cross-talk) de sinalização inflamatória e fenótipos neurológicos.

GIT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GIT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GIT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GIT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GIT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GIT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GIT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GIT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GIT1 em células tumorais com expressão de GIT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.