GIT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402136-ACT

Il GIT1 umano (G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1) è una proteina scaffold associata alle proteine attivanti la GTPasi ARF che coordina il turnover delle adesioni focali, il traffico recettoriale e il rimodellamento del citoscheletro di actina. Attraverso interazioni con proteine quali le GRK, la paxillina e componenti dei complessi endocitici e di adesione, GIT1 contribuisce a integrare i segnali provenienti dai GPCR e dai recettori tirosin-chinasici in vie che controllano la migrazione, la dinamica dei lamellipodi e l’organizzazione sinaptica/neurale. La segnalazione legata a GIT1 è stata studiata in contesti che includono il comportamento cellulare invasivo, le risposte angiogeniche e vascolari e i processi neuro-sviluppativi in cui la regolazione dell’adesione e del citoscheletro è cruciale. Un’espressione deregolata o un’alterata connettività della rete di GIT1 è quindi rilevante per la ricerca meccanicistica sulla motilità delle cellule tumorali, sul cross-talk della segnalazione infiammatoria e su fenotipi neurologici.

GIT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GIT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GIT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GIT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GIT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GIT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GIT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GIT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GIT1 nelle cellule tumorali con espressione di GIT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.