Plasmide CRISPR d'Activation (h) GIT1: sc-402136-ACT

Le GIT1 humain (G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1) est une protéine d’échafaudage associée aux protéines activatrices de la GTPase ARF, qui coordonne le renouvellement des adhérences focales, le trafic des récepteurs et le remodelage du cytosquelette d’actine. Par ses interactions avec des protéines telles que les GRK, la paxilline et des composants des complexes d’endocytose et d’adhérence, GIT1 contribue à intégrer les signaux issus des GPCR et des récepteurs à activité tyrosine kinase au sein de voies contrôlant la migration, la dynamique des lamellipodes et l’organisation synaptique/neurale. La signalisation liée à GIT1 a été étudiée dans des contextes incluant le comportement cellulaire invasif, les réponses angiogéniques et vasculaires, ainsi que des processus neurodéveloppementaux où la régulation de l’adhérence et du cytosquelette est déterminante. Une expression dérégulée ou une connectivité altérée du réseau de GIT1 est donc pertinente pour la recherche mécanistique sur la motilité des cellules cancéreuses, la diaphonie des voies de signalisation inflammatoires et les phénotypes neurologiques.

GIT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GIT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GIT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GIT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GIT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GIT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GIT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GIT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GIT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GIT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.