Fyn Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-420431-ACT-2

Il gene Fyn del topo codifica una tirosin-chinasi non recettoriale della famiglia Src che funge da nodo di segnalazione prossimale a valle di recettori immunitari, integrine e recettori per fattori di crescita, regolando—attraverso meccanismi dipendenti dalla fosforilazione—la dinamica del citoscheletro, l’adesione cellulare, la migrazione e la proliferazione. Nei linfociti T e in altre linee ematopoietiche, Fyn contribuisce alla segnalazione del TCR e all’attivazione immunitaria tramite vie che includono MAPK/ERK, PI3K–AKT e la modulazione di complessi di fosfatasi e adattatori, mentre nel sistema nervoso influenza la segnalazione sinaptica e processi legati alla mielinizzazione. Un’attività deregolata di Fyn è stata associata, in sistemi modello, ad alterazioni delle risposte infiammatorie, a segnalazioni correlate alla neurodegenerazione e a reti di segnalazione oncogeniche, rendendolo rilevante per studi sulla regolazione immunitaria, sulla funzione neuronale e sulla biologia dei tumori. L’editing genetico di Fyn nel topo consente la dissezione meccanicistica di vie dipendenti dall’attività chinasica, di reti di fosforilazione e di fenotipi specifici per tipo cellulare in vitro e in vivo.

Fyn Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fyn senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fyn Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fyn nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fyn, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fyn. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fyn nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fyn nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fyn nelle cellule tumorali con espressione di Fyn silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.