FOG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402620-ACT

Lo ZFPM1 umano codifica Friend of GATA-1 (FOG), un cofattore trascrizionale multi–dito di zinco che si lega alle proteine della famiglia GATA per modulare programmi genici specifici di linea. FOG coordina complessi della cromatina sia attivatori sia repressori, inclusi i macchinari associati a NuRD/HDAC, per regolare la differenziazione eritroide e megacariocitica, oltre a uno sviluppo ematopoietico più ampio. Grazie al controllo di reti trascrizionali che governano l’impegno del destino cellulare, ZFPM1 è spesso studiato in vie che plasmano l’ematopoiesi, la biologia delle piastrine e la regolazione genica dello sviluppo. Un’attività di ZFPM1/FOG deregolata e un alterato bilanciamento dei cofattori GATA sono rilevanti per una differenziazione ematopoietica anomala e per i relativi modelli di ricerca su patologie del sangue e dello sviluppo.

FOG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZFPM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FOG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZFPM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZFPM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FOG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZFPM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FOG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FOG nelle cellule tumorali con espressione di ZFPM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.