FN3K Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412985-ACT

Il gene umano FN3K codifica la fructosamina-3-chinasi, un enzima citosolico che fosforila la fructosilisina e chetoammine correlate presenti sulle proteine glicate, promuovendone l’instabilità e la successiva deglicazione. Limitando l’accumulo di prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) e la disfunzione proteica mediata dalla glicazione, FN3K contribuisce alla proteostasi e all’omeostasi metabolica redox-sensibile in condizioni di elevato flusso di glucosio. L’attività di FN3K si interseca con il metabolismo dei carboidrati e con le risposte cellulari allo stress modulando il carico di glicazione proteica non enzimatica. Alterazioni dell’espressione o della funzione di FN3K sono state studiate in relazione alla disregolazione metabolica e alle complicanze legate all’iperglicemia cronica, nonché a effetti più ampi sul controllo di qualità delle proteine.

FN3K Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FN3K senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FN3K Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FN3K nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FN3K, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FN3K. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FN3K nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FN3K nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FN3K nelle cellule tumorali con espressione di FN3K silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.