FHOD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404286-ACT

FHOD1 (formin homology 2 domain containing 1) codifica una formina correlata a Diaphanous che catalizza l’assemblaggio lineare dei filamenti di actina e coordina il crosstalk tra actina e microtubuli per controllare la forma cellulare, l’adesione e la migrazione direzionale. L’attività di FHOD1 influenza le vie di rimodellamento del citoscheletro collegate alle GTPasi Rho e contribuisce alla formazione di fibre da stress e di strutture actomiosiniche contrattili. Grazie al suo ruolo nella dinamica del citoscheletro, FHOD1 è stato associato a processi rilevanti per il rimodellamento tissutale, il comportamento cellulare invasivo e la motilità deregolata osservata in molteplici contesti patologici, inclusa la biologia dei tumori. Modulando l’espressione di FHOD1 è quindi possibile analizzare i meccanismi di meccanotrasduzione, polarizzazione cellulare e fenotipi dipendenti dalla migrazione in sistemi modello umani.

FHOD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FHOD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FHOD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FHOD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FHOD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FHOD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FHOD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FHOD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FHOD1 nelle cellule tumorali con espressione di FHOD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.