EYA1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420254-ACT

Eya1 codifica o coativador transcricional e a fosfatase de tirosina EYA1, um regulador-chave da organogênese e das decisões de destino celular durante o desenvolvimento em camundongos. A EYA1 atua em programas de transcrição nuclear com os fatores SIX e DACH e também participa de sinalização dependente de fosforilação que influencia proliferação, sobrevivência e diferenciação. Sua atividade está intimamente ligada a vias de desenvolvimento que controlam a formação de órgãos sensoriais, a nefrogênese e o padrão craniofacial, tornando Eya1 um gene-modelo amplamente utilizado para estudar redes de regulação gênica. Alterações na dosagem ou na regulação de Eya1 estão associadas a fenótipos congênitos do desenvolvimento e oferecem um ponto de entrada mecanístico para dissecar o controle da morfogênese dependente de transcrição e de fosfatase.

EYA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Eya1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EYA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Eya1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Eya1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EYA1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Eya1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EYA1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EYA1 em células tumorais com expressão de Eya1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.