ETAR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401000-ACT

EDNRA codifica il recettore dell’endotelina di tipo A (ETAR), un recettore accoppiato a proteine G che lega preferenzialmente l’endotelina-1 per regolare la vasocostrizione e il tono della muscolatura liscia vascolare. La segnalazione di ETAR coinvolge principalmente Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, aumentare il Ca2+ intracellulare e stimolare vie dipendenti da PKC, con effetti a valle su MAPK/ERK e Rho/ROCK che influenzano contrazione, proliferazione e rimodellamento della matrice extracellulare. In contesti endoteliali e stromali, l’attività di EDNRA si interseca con segnali di ipossia e infiammazione che modellano le risposte angiogeniche e fibrotiche. Un’espressione o una segnalazione deregolate di EDNRA sono state associate al rimodellamento cardiovascolare e vascolare polmonare, all’ipertensione sistemica e alla biologia stromale associata ai tumori, supportandone l’utilità come bersaglio meccanicistico nella ricerca focalizzata sulle vie di segnalazione.

ETAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDNRA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ETAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDNRA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDNRA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ETAR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDNRA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ETAR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ETAR nelle cellule tumorali con espressione di EDNRA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.